Washington begann seine Leinwandkarriere im Fernsehen, wo er in den Seifenopern As the World Turns und One Life to Live auftrat. Sein Debüt auf der großen Leinwand gab er in Spike Lees Crooklyn (1994), und anschließend spielte er in Lees Clockers (1995), Girl 6 (1996) und Get on the Bus (1996), wobei er im letztgenannten Film einen schwulen Mann spielte, der auf dem Weg zum Million Man March 1995 in Washington, D.C. ist. Isaiah Washington verdiente sein Vermögen als Schauspieler in mehreren Spike Lee-Filmen sowie in der ABC-Serie Grey’s Anatomy, wo er die Rolle des Dr. Preston Burke spielte. Er wurde in Houston, Texas, geboren und ist seit 1991 Teil der Schauspielgemeinschaft.
Ein von African Ancestry, Inc. durchgeführter genealogischer DNA-Test ergab, dass Washingtons mütterliche Abstammung auf das heutige Sierra Leone zurückgeführt werden kann. Im Mai 2006 reiste er nach Sierra Leone und erhielt die sierra-leonische Staatsbürgerschaft. Damit ist er der erste Afroamerikaner, dem die volle Staatsbürgerschaft auf der Grundlage der DNA zuerkannt wurde.
